リサウイルス属内のウイルスは人獣共通病原体である。ヒト^症例1に関連する少なくとも7つのリサウイルス種がある。この属1、2、3、台湾コウモリリッサウイルス(TWBLV)4およびコタラチコウモリリサウイルス5の16種に加えて、最近コウモリで同定されているが、彼らの分類状態はまだが決定されます。

コウモリは、モコラ・リッサウイルスおよび生駒リッサウイルスを除いて、ほとんどのリッサウイルスの自然宿主であり、まだどのコウモリ1、2、3、6でも同定されていない。アジアのコウモリのリサウイルスに関する情報はまだ限られています。アジアのコウモリ(インドとタイで1つ)7、8の特徴のないリサウイルスが2つ報告されています。中国では2002年にコウモリ咬傷に関連する1例の狂犬病例が報告されたが、診断は臨床^観察9によってのみ行われた。中央アジアでは、1991年にキルギスのマウス耳の小さいコウモリ(ミオティス・ブリチ)でアラバン・リッサウイルスが同定され、2001^年10月にタジキスタンのひげ付きコウモリ(ミオティス・ミスタチヌス)でクジャンド・リサウイルスが同定された。南アジアでは、2015年3月^にスリランカのインドのフライングキツネ(プテロプス・メディウス)でガンノールワコウモリのリサウイルスが確認された。東南アジアでは、フィリピン、タイ、バングラデシュ、カンボジア、ベトナムのコウモリに関するいくつかの血清学的研究が、可変血清原性11、12、13、14を示した。 ¹⁵.イルカト・リッサウイルスは、2012年16年に中国吉林省の大きな管鼻コウモリ(ムリナ・ロイコガスター)で同定されたが、東アジアのコウモリ集団におけるリッサウイルスの正確な種と場所は不明のままである。

台湾のコウモリ集団におけるリッサウイルスの存在を評価するために、直接FATとRT-PCRの両方を用いた監視プログラムが開始された。台湾コウモリのリサウイルスは、2016~2017年に日本ピピストレルス・アブラムス(ピピストレルス・アブラムス)4例の2例で同定された。本論文では、台湾におけるコウモリ集団のリサウイルス監視に関する実験室標準手術手順を紹介する。本研究室におけるコウモリリサウイルス診断のフローチャートを図1に示す。

1. リサウイルスの取り扱い時の安全上の注意

1. コウモリの標本を扱うすべての実験室労働者が事前暴露狂犬病^予防17を受け取ることを確認してください。あらかじめ労働者の狂犬病抗体レベルを監視し、6ヶ月ごとに再検査^17.抗体レベルが0.5 IU/mL¹⁷より低い人には、狂犬病の予防接種が必要です。
2. 研究室がある国のバイオセーフティ規制に応じて、適切なバイオセーフティレベルのラボ(例えば、台湾のBSL-2研究所およびオーストラリアのBSL-3研究所)で以下の手順が実行されることを確認し、労働者は現在資格を有し、適切な個人用保護具^{を着用しています 18.}
   注:狂犬病のワクチン接種は、フィログループIIおよびIII¹⁸に属するリサウイルスからの保護をほとんどまたは全く提供しない。労働者は、いくつかの動物性病原体が^{Johnstons - 【即日発送】ジョンストンズ　カシミア　大判　バーガンディ}で同定されたことを知らされなければならず、適切な個人用保護具を用いて適切なバイオセーフティレベルの実験室条件下でサンプルを処理する必要があります。

2. サンプルコレクション

1. 弱いまたは病気のコウモリや死体を使用してください。
   注:弱いコウモリや病気のコウモリは、獣医のケアや研究のために台北のコウモリ保護協会に届けられ、死体は動物衛生研究所に直接提出されます。この監視プログラムでは、健康なコウモリは安楽死させられていない。
2. コウモリの生態学者が形態学的^特性20を通じてコウモリ種を同定する。
3. リッサウイルス陽性が診断されたときにコウモリ種のDNAバーコードを行い、以前に公表された^手順21を用いて。
4. 各コウモリの死体(採取部位、種、臨床徴候など)の情報シートを提出する。

3. コウモリ標本の壊死

1. 材料を準備します。
   1. きれいな解剖板を準備し、壊死のための滅菌吸収パッドを置きます。
   2. コウモリの臓器を収集するための収集チューブを準備します。
   3. 使い捨てピンセットと壊死のためのメスを準備します。各コウモリの壊死の間にツールを変更します。サンプリング中にピンセットとメスを洗浄するために70%エタノールで湿らせた綿玉を準備します。
   4. FAT用の2つの顕微鏡スライドを準備します。新鮮な標本を収集し、病理学的検査のためのホルマリン溶液でそれらを固定します。
2. 壊死の前にすべての外部オリフィスを調べます。コウモリの外的特徴、特に頭、耳、翼を写真に撮り、種分化を行います。
3. 経口綿棒サンプルを収集します。ボード上の腹部の直立にコウモリを置き、ピンセットでバットの頭を固定します。メスでカルバリアの中線に沿って皮膚をカットし、側面に皮膚を引っ張ります。メスでカルバリアの中線に沿って頭蓋骨をカットし、脳組織を露出させるためにピンセットでそれを開きます。
4. 頭蓋骨から脳組織を取り出し、無菌舌圧下に置き、脳組織から印象を塗り付けます(ステップ4.2参照)。新鮮な脳組織の小片を収集し、組織病理学的検査のためにホルマリンでそれを修正します。核酸抽出のためのチューブ内の残りの脳組織を含む。
5. 70%のエタノールで湿った綿のボールできれいなピンセットとメスは、標本コレクション間の保持された組織を除去します。
6. 後部の直行でボード上にバットを置き、軸索と尾かかとの両側に針でボード上に固定します。
7. 体の中間線に沿って皮膚をマンディブルからアナスに切開します。ピンセットで皮膚と下の筋肉組織を持ち上げ、分離します。顎骨の近くにある唾液腺を採取する。
8. ピンセットでわずかに胸骨を持ち上げ、メスで中間線に沿って胸骨と腹壁をカットします。メスで鎖を切る。左右の肋骨ケージを針でボードに固定し、胸腔を開きます。
9. 総病変と死後変化の程度を記録します。
10. ピンセットとメスを使用して死体から内臓組織(すなわち、心臓、肺、肝臓、腎臓、腸)を取り除きます。将来の研究のために必要に応じて内臓標本を収集します。
    注: 重複するサンプルのコレクションをお勧めします。一方は分子診断のために収集されるべきであり、もう一方はウイルス培養用のウイルス輸送培地の有無にかかわらず-80°Cで凍結^{されるべきである22。}

4. 直接蛍光抗体検査(FAT)

1. FAT の脳組織の印象の塗りつぶしを作成します。前述の^18,23に従って FAT を実行し、次の変更を行います。
2. ピンセットで接続された神経組織から脳組織を穏やかに分離し、脳組織を無菌舌圧下器に移す。脳幹と小脳を含む脳の断面を切る^18,23.脳組織の切断面に軽く触れることで脳組織の印象を塗り、レンズ組織のスライドを押して余分な組織を取り除きます。
3. -20 °Cでスライドを30分間アセトンで固定し、コンジュゲートで染色する前に、テストしたスライドと正と負のコントロールを乾かします。
4. リサウイルス抗原を染色するための2つの市販のFITC結合抗狂犬病抗体のそれぞれを使用することは強く推奨23。最初の染色の前に商業コンジュゲートの作動濃度を決定する。希釈したコンジュゲートを0.45 μMシリンジフィルターを通してスライドに落とし、湿ったチャンバー内で30分間37°Cでスライドをインキュベートします。
5. スライドから余分なコンジュゲートを排出し、インキュベーション後にリン酸緩衝生理食べ物(PBS)でスライドを洗浄します。
6. スライドに少量の10%グリセロールをドロップし、カバースライドでカバー.
7. 蛍光顕微鏡でスライドを調べます。

5. 核酸抽出

1. 脳組織にMEM-10(10%の胎児ウシ血清を補充した最小必須培地)の適切な体積を脳組織に加える(10%w/v)。
2. ホモジナイザー器具で5mmのスチールビーズで脳組織をホモジネートし、遠心分離機を825 x gで10分間使用します。
3. 核酸を抽出し、そのうち最終体積は50μLであり、市販の全核酸抽出キットを器具で用いて上清の200μL以内に抽出する。

6. RT-PCRと系統解析

注:いくつかのプライマーセットは、すべての既知のリサウイルスまたは特定のリサウイルスを検出するために公開されています。ここで説明するプロトコルは、私たちの研究室が使用し、すべての実験ニーズに適合しない場合があります例です。実験室の必要性に従って適切なプライマーを選びなさい。

1. 1ステップRT-PCR試薬を以下のように準備する:10倍の反応バッファーの2.5 μLを含む反応混合物に抽出された核酸の5 μLを加え、フォワードとリバースプライマーの0.5 μL(各々10 μM)、4 μLの1.25mM dNTP、0.3 μLのRNase阻害剤(40 μL)を追加します。、逆転写酵素の0.3 μL(10 U/μL)、DNAポリメラーゼの0.4 μL(5 U/μL)、およびDEPC処理水の11.5 μL。
   注: このプロトコルで使用されるプライマー セットは、JW12 (5'-ATGTACACCYCTACAATG-3') および N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTTATACTATA-3')²⁴です。使用するプライマーセットに従って試薬およびサイクリング条件の調製を修正する。
2. 次の条件下でサイクリングを実行します: 42 °C でのインキュベーション 40 分;10分間94 °Cで初期退化;30 s のための 94 °C の 35 サイクル、 30 s のための 55 °C、30 s のための 72 °C;そして最後に、10分間72°Cでさらに延長する。
3. 別のプライマー・セットを使用して、診断の感度を高める。
   1. N113F(5'-GTAGGATATGGG-3')とN304R(5'-TTGACGAAGATCTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCATCAT-3')25、26を使用して、次のように1ステップRT-PCR試薬を調製する:5 μLの混合物を含む反応に5 μLを添加し、5μL μLμLを含む反応に添加する。フォワードおよびリバースプライマー(各4μM)、1.25mM dNTPの5μL、RNase阻害剤の0.5 μL(40 U/μL)、0.2 μLの逆転写酵素(10 U/μL)、1μLのDNAポリメラーゼ(5 U/μL)、および23.3 μLのDEPC水処理量。
   2. 次の条件下でサイクリングを実行します: 42 °C でのインキュベーション 40 分;5分間95 °Cで初期退化;1分のための95 °Cの35サイクル、1分と20sのための55 °C、および1分のための72 °C;そして最後に、10分間72°Cでさらに延長する。
      注:実験室の必要性に応じて、診断のための適切なプライマーを選ぶ。N113Fはもともと狂犬病ウイルス増幅用に設計されましたが、他のリッサウイルスにはうまく機能しない場合があります。N113FおよびN304Rのセットは狂犬病ウイルス(台湾フェレットバガー変異体)および台湾のコウモリのリサウイルスのためによく働く。ライサウイルスが上記の2つのプライマーセットの両方によって増幅された場合、JW12およびN304Rプライマーのセットを使用して、全核タンパク質配列を得ることが容易になります。
4. 2%アガロースゲル電気泳動のPCR製品を分析し、紫外線照光で可視化します。
5. 商用シーケンシング サービスによって PCR 製品を順序付けします。
6. ヌクレオチド基本ローカルアライメント検索ツール(BLAST)のウェブページにシーケンスを入力またはアップロードします。「その他(nrなど)」データベースを選択し、生物をリサウイルスとして入力します。メガブラストアルゴリズムを選択し、BLASTを実行します。

7. ウイルスの隔離

注: 1) FAT または 2) RT-PCR が陽性を示す場合は、ウイルスの単離を実行します。

1. MEM-10で10%(w/v)懸濁液で脳標本を均質化する。825 x gで 10 分間遠心分離機。
2. MEM-10の1 mLで3 x 10⁶ MNA(マウス神経芽細胞腫)細胞の懸濁液を用い、200μLの上清を1%CO2で37°Cで1時間接種する。脳ホモジネート細胞懸濁液を25cm^{Ungrid - ボンディングガウチョ 取り置き}フラスコに移し、MEM-10の6 mLを加える。
3. 直径6mmの4ウェルテフロン被覆ガラススライドで脳ホモジネート細胞懸濁液の1mLを同時に栽培する。
4. 1%CO₂で37°Cでインキュベーションの3〜4日後、100%アセトン(v/v)で4ウェルスライド上の細胞を固定します。
5. ステップ4.4-4.7に続く2つのFITC結合抗狂犬病抗体でスライドを汚します。細胞は、細胞内包含物を調べると感染する。感染した細胞の割合を記録します。
6. スライドが陰性として染色された場合、接種細胞培養のトリプシン化およびサブ培養を行います。
   1. 培地を取り出し、5 mLのPBSでフラスコをすすいで下します。
   2. フラスコに1mLのトリプシンを加え、フラスコの底をしっかりと打ちます。
   3. MEM-10の6 mLを追加し、細胞を再中断します。
   4. 細胞懸濁液を新しい組織フラスコ(6 mL)に入れ、4ウェルスライド(1 mL)に入れておきます。
7. 100%の感染率に達するまで、手順7.4~7.6を繰り返します。
8. インキュベーションの24時間後に上清を収集します。

2014年から2017年5月まで、13種から332種のコウモリの死骸が監視対象として収集されました。2つのテストは陽性でした。第1打席では、市販のFITC結合抗狂犬病抗体(図2)を用いてFATを用いて負の脳印象をテストし、RT-PcRは2つのプライマーセット(JW12/N165-146、N113F/N304R)をそれぞれ採用した。肯定的な結果 (図3)アンプリコンの428bp配列(N113F/N304Rで増幅し、部分核タンパク質遺伝子を含有する)が得られた。そのシーケンスは、GenBankデータベースによるBLASTクエリを行いました。その結果、この配列は79%未満のアイデンティティを有するリサウイルスに類似しており、検出されたリサウイルスのアイデンティティを支持することが示された( 図4)。

その後、2つのライサウイルスをこれら2つの脳から正常に単離し、FAT(図5)とシーケンシングによってウイルスを確認した。同定されたリサウイルスは、配列分析4に基づいて台湾コウモリリサウイルス(TWBLV)として指定された。第2のケースでは、2つの市販のFITC結合抗狂犬病抗体のそれぞれを用いたFATから得られた結果は、第1のケースで説明されているように一貫性がありませんでした。

図1:コウモリリサウイルス診断フローチャート。
当研究室が現在使用している現在のプロセスと診断方法を示すフローチャート。ウイルス単離は、直接蛍光抗体試験または逆転転写ポリメラーゼ連鎖反応が陽性である場合に行われるべきである。Countryman E6DW6L1AL Springy E6 Directional Earset with 1 mm Cable for Audi

図2:TWBLV感染バットからの全脳圧迫の2つの市販のFITC結合抗狂犬病抗体を用いた直接FATは、一貫性のない結果をもたらす。
症例番号: 2016-2300: (A) 試薬A(5x希釈)を持つFATは、リンゴの緑色の正の信号を実証します。(B)試薬Bを伴うFATは、陰性の結果(20倍希釈)を示す。

図つのプライマーセットを採用したRT-PcRの製品。
レーン1~3で使用するプライマーセットはJW12/N165-146で、予想製品サイズは111基でした。レーン4~6で使用されるプライマーセットはN113F/N304Rで、期待される製品サイズは521ベースペアでした。サンプル(レーン1および4)の両方の試験は陽性であった。M = 100 bp DNAはしご;レーン 1 と 4 = テスト済みサンプル。レーン 2 と 5 = 正のコントロール。レーン 3 と 6 = 負のコントロール。

図4:TWBLV感染バットのN113F/N304R産物のBLAST結果。
BLASTの結果は、症例がリサウイルスに最も類似していることを示したが、データベース内のライサウイルスとの同一性はわずか79%であった。

図5:TWBLVのウイルス単離のリッサウイルス抗原分布と2つのFITC結合抗狂犬病コンジュゲートの比較。
10%コウモリの脳エマルジョン(TWBLV感染)をウイルス単離のためにマウス神経芽細胞腫細胞に接種した。FATは10回目の通路で行い、2つのFITC結合抗狂犬病抗体で染色した。2つの狂犬病コンジュゲートを有するマウス神経芽細胞腫細胞の抗原分布は有意な差を示した。(A) 試薬A(5倍希釈)を伴うFAT。(B) 試薬Bを含むFAT(5倍希釈)。

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FATは狂犬病の診断に最も広く使用されている方法であり、OIEおよびWHO¹⁸によって推奨されているが、FAT 5、27で異なるコンジュゲートが使用された場合、いくつかの研究は一貫性のない結果を示した。同様の矛盾した結果は、TWBLV感染症例にも現れた。TWBLV感染MNA細胞では、FATの結果は2つのコンジュゲートで有意な差を示した(図5)。FITC結合抗狂犬病抗体の1つは、より高い濃度でもうまく反応しなかった。サンプル中のリッサウイルス抗原の変動とコンジュゲートにおける抗体の熱心性と抗体の親和性の変動のため、リッサウイルスにおける偽陰性の結果を防ぐためにFATで2つの異なるコンジュゲートを使用することをお勧めします。診断^23,28,29.

RT-PCRはFATの矛盾した結果のための確認の診断を提供できる。ライサウイルスの遺伝的多様性が高いため、RT-PCRに設定された複数のプライマーを使用して、リッサウイルススクリーニング29,30の精度を高めることをお勧めします。高度に保存された核タンパク質遺伝子から設計されたプライマーセットは、リサウイルス^検出29で最も一般的に使用されるセットである。RT-PCRは、FATが31、32を実行できない場合に、プトレファアクティブサンプル^{Panasonic - 【新品】ロボット掃除機 MC-RS310-W パナソニック ルーロ RULO}の診断にも使用できます。新しいリッサウイルスの発見を防ぐ偽の否定性を避けるために、より多くのツールを検出することをお勧めします。2つの新しいリサウイルス4、台湾コウモリリサウイルス、SOPを用いたこの調査で同定された。

さらに、2018年に台湾のコウモリで、非常に多様なTWBLV株と新種のリッサウイルスが発見されました(未発表データ)。この研究結果は、コウモリ中のリッサウイルスを検出するFATとRT-PCRの両方の雇用が有用であることを証明した。この SOP で使用される RT-PCR プライマー セットのいくつかの制限事項に注意してください。N113F/N304Rのプライマーセットでは、N113Fはもともと狂犬病ウイルス増幅用に設計されましたが、他のリッサウイルスにはうまく機能しない場合があります。リッサウイルス検出のためのいくつかのプライマーは、他の研究者によって29、30によって発表されており、実験室のニーズに応じて選択することができます。

この記事は、台湾のコウモリリサウイルス監視のステップバイステップの紹介です。このSOPは、コウモリのリサウイルス監視に興味を持っている研究者に役立つことが期待されます。より多くの研究者がコウモリの調査を行うにつれて、より多くのリサウイルスが将来的に同定されるでしょう。このSOPは、リサウイルスだけでなく、コウモリの他の動物園のエージェントを監視します。このような知見は、コウモリや他の野生動物との接触の潜在的なリスクを公衆、医療専門家、および科学者に知らせることができます。また、リッサウイルスの進化と起源の理解を深め、科学研究の大きな進歩につながります。